LAC参考文献


PCRを始めませんか

長崎大学医学部附属動物実験施設  大沢一貴

図表は省略しました。図表を含む全文は"日本実験動物技術者協会九州支部会報、No.20、7-15, 1996 に掲載されたものです。

《はじめに》 PCR (polymerase chain reaction) という名が世に出てから10年以上が経過した。その間の技術進歩はめざましく、DNA増幅装置(サーマルサイクラーはシータス社の商品名)の開発、高度好温菌 (Thermus aquaticus: Taqの由来) ポリメラーゼの利用などを経て、今日では分子生物学の分野において、最も頻繁に利用される主要技法となっている。この業績を讃え、開発者 Kary B. Mullis には1993年に日本国際賞、翌年にはノーベル医学生理学賞が授与されている。数ある技法の中でPCRほど多くの分野で広く活用されているものは少なく、これはひとえに "誰でも簡単にでき" かつ "再現性の高い" 手法として確立されているからにほかならない。実験動物関連分野においても、遺伝的モニタリングや感染症の遺伝子診断に応用されつつあるが、いまだに一般的とは言い難いのが現状のようである。当施設においても、PCR法を用いたウイルス感染症の遺伝子診断が可能になったのは、最近のことである。 再現性の高い診断が誰にでも可能とあらば、これを活用しない手はない。この講座では、ウイルス感染症の診断を目的としたPCR法を、スタートさせるまでの過程を顧みながら、なるべく具体的に紹介する。

《どうやら向き不向きがあるようです》 これから紹介する手法には、ng単位の核酸を扱うコマゴマとした作業や、会話のできない緊張した時間がつきものです。ある程度 "目" の達者な人にお勧めします (核酸抽出時に沈殿が見えないとちょっとつらい)。また、チップの先端が素手や実験台に接触したのに気付かずに、汚れたチップでRNA液を採るようなことは避けねばなりません。五感の末端にまで神経の行き届いた実験を得意とする方にどちらかというと向いています。無神経なのはチップと手袋ぐらいに留めたいものです。

《PCRの原理》 PCR法の詳細ついては良書が多く、今回は、その概略を図1に示すにとどめる。 DNAを一本鎖に変性(denature) し、鋳型のテンプレート(template) DNAとプライマー(primer) とを相補的にアニール(anneal) させ、温度を正確かつ速やかに変化させることによって、プライマーとプライマーの間の領域のみを (計算上)指数関数的に増幅させることができる。このような部分的クローニングが、多少の試薬を混ぜて機器にセットするだけで、なんと3時間以内に完了(その間は他の実験ができる) してしまう。最近では、読み違えた延長(extension) を修復する機能を持たせた酵素を利用することにより、10 kbp以上の長さの、かつ忠実度(fidelity) の高いlong PCRも可能になっており、応用範囲はさらに広がりつつある。

《準備するもの》

  1. 試薬  さしあたって、1) 鋳型となるDNA (テンプレートDNA)、2) プライマー、3) DNAポリメラーゼ、4) dNTPs、5) バッファー等 が必要となる。

  1. テンプレートDNA  DNAウイルスのゲノムの一部を増幅させる場合は、抽出したDNAそのものをテンプレートとするPCRを行う。DNAウイルスのmRNAやRNAウイルスを標的とする場合は、RNAを抽出して逆転写反応を予め行い、このcDNA(ここではRT product) をテンプレートとしてPCRを行う(RT-PCR)。DNAやRNAの抽出方法(図2) については後述する。
  2. プライマー  PCRでは、図1に示したように、一対のプライマーの間の領域のみが増幅するので、増幅させたい領域を挟んで、その外側にプライマーの位置を設定する必要がある。プライマーの長さは20塩基前後が一般的で、200円/塩基 以内で購入することができる(通常のPCRには、脱塩処理のみの未精製品で充分)。凍結乾燥品をTris-EDTA(TE, pH 8) で溶解し、使用前に100 pmoleに調製しておく(DNaseがMg2+を補酵素とするので、EDTAはDNA分解防止の目的で加える)。  プライマーの位置や配列は、ランダムプライマーを用いる場合を除いて、塩基配列を前もって検索し、その中から決定する。最近では、論文中に長大な塩基配列そのものが掲載される例は少ないので、DNASIS(宝酒造) などのデータベース付きの遺伝子解析アプリケーションソフトや、インターネット でアクセス可能 Genebank (http://alces.med.umn.edu/gbsearch/)やEBI (http://www.ebi.ac.uk/) を大いに活用していただきたい。また、国内外のftpサイトからフリーウェアの解析ソフト(SeqVu、DNAid、SeqPupなど)も入手可能である。 プライマーの塩配配列は、
    1. 1組のプライマー同士でGC% がほぼ同じ(GC% は、プライマーがテンプレートとの対合のしやすさ、すなわちアニールの温度に影響する)、
    2. プライマー内あるいはプライマー同士で対合しない(1対のプライマーの末端の各数塩基が互いに相補的でないなど)、
    3. 特定の塩基に極端に偏らない(4つ以上同一塩基が連続しない)という3つの条件を満たしていればほぼ充分と思われる。化学的に最良のプライマー位置を決定するには、解析ソフトの助けを借りる必要があろうが、合成プライマーが容易に入手できる今日では、トライ and エラーで失敗を覚悟の上で、" とにかくやってみる "のが成功への近道である。当然のことながら、プライマーの向き(特にアンチセンスのプライマーに注意!)や塩基配列のミスは致命的となるので注意をしたい。ウイルス感染症の診断にあたっては、ウイルス側の要因、すなわち不完全ウイルスゲノム粒子の存在や、転写されるmRNAの経時的変化を考慮する必要も生じてくる。  なお、プライマーの設定方法やTm値の計算方法については文献3に詳しいので参考にしていただきたい。
  3. DNAポリメラーゼ  筆者はEx Taq (宝酒造)とAmpliTaq Gold (Perkin Elmer: PE) を使い分けている。
  4. dNTPs  dATP、dTTP、dGTP、dCTPの4種のヌクレオチド-3リン酸の混合試薬。 RT-PCRやプローブの標識を行う場合には、10 mM eachや標識dNTPs液を調製する必要がある(10 mMのdNTPsは40 mMのヌクレオチドを含んでいることに注意)。極端な濃度調製のミスは致命的なので、細心の注意を。
  5. バッファーと超純水  もっぱら添付されている10x bufferを使用している。これを、最終的に滅菌超純水等(当然、DNaseや核酸、タンパクなどはフリー) で10倍に希釈する。また、DNAを希釈する際に多用されるTris-EDTA液(TE:) は、かえってPCRバッファー中では実質的Mg2+濃度を低下させる。それを補う意味でMgCl2を増強する場合もある。

2. 機器

  1. DNA増幅装置  70〜80万円で標準的な装置を購入することができる。操作性のことを考えれば、オイルフリーの0.2 μlチューブを、大量のサンプルを扱う場合には96穴プレートをそれぞれ使用できるタイプがお勧めである。当施設では、 GeneAmp 2400(PE) とTP3000 (宝酒造)を目的に応じて使い分けている。
  2. 電気泳動関連装置等  PCR産物の確認に用いる。広範囲のDNAを分離できる高分解能アガロース(FMCのMetaPhor XRなど) を用いれば、ミニゲル(Mupidなど) で充分対応できる。得られたバンドが本来の目的とするものなのか否かを、サザンブロッティングや制限酵素法で、一度は確認することが必要であろう。 UV発生装置のほか、エチジウムブロマイドやサイバーグリーンなどの発色剤や写真撮影装置(画像解析装置があればなお良い)も必需品 。
  3. Vortexミキサーと小型卓上遠心機  解凍後の溶液の均質化や複数の液体の混合のため、Vortexミキサーを汎用する。さらに、混ぜた後にはスピンを行い、蓋の裏側に付着した液体を落とすことが、コンタミ防止のために欠かせない。ミリポア社の" チビタン "(製造はトミー) がコンパクトでお勧め。
  4. ホモジナイザー  少量であれば手動式で充分ですが・・・。
  5. マイクロチューブ用遠心機  最低15,000 rpmは必要です。
  6. ピペッター、チップ、チューブ他  0.1 μlの酵素を扱い、あるいは500 μlの超純水を一度に使用する場合を考慮し、適切なピペッターを選択したい。精度保証範囲以下でも、かえってストロークが長い方が使いやすい場合か多い(極少量の場合でも、ギルソンP-10で充分)。  チップ、チューブはすべて新品のものを使用する。その他、使用する液体はすべてオートクレーブにかけ、RNAを対象とする過程ではDEPC処理滅菌超純水を使用する方がよい場合もある(DEPCの残留は、PCRを阻害するといわれているので、むやみな使用は逆効果)。

《実際に始めよう》

  1. DNAの抽出  ウイルスに感染した臓器や細胞をホモジナイザーで乳剤にして、以下の処理を行う。細胞由来のDNAがほとんどを占め、多少のRNAも混入するので、沈殿が見えてもウイルスDNAが採れたという保証はないので、PCRで確認するまでは安心はできない。

  1. 750μl臓器・細胞乳剤   750μlTE飽和フェノール(pH 8)/クロロホ ルム/イソアミルアルコール(25: 24:1)*   * いずれも市販品(ニッポンジーンなど)で、数字は容積比混合液
  2. Vortexを10秒間以上行って、全体が白濁するまでよく混ぜ、12,000 rpm で5分間遠心する。
  3. 沈殿を避けて水層のみを別のチューブに採る。ここで白い沈殿が混入(タンパク質が除外できていない)した場合は、再度フェノール処理を繰り返す。
  4. 1容水層1/10容 3 M 酢酸ナトリウム(pH 5.2)と3容 冷却100% エタノール を混合し、-80℃以下にまで冷却する (ディープフリーザーやドライアイス) 。これでDNAが析出してくる。
  5. 15,000rpmで5分間遠心し、その上清を捨てる。白いペレットが見えるはずです。
  6. 1ml室温の70% エタノールを加えて、ペレットを壊さないように軽く振る。
  7. 15,000rpmで5分間遠心し、その上清を捨て、ペレットを風乾する。乾燥しすぎるとDNAが溶けにくくなので注意。
  8. 適量の滅菌超純水(TE液(pH 8)でも可) で溶解する。

2. RNAの抽出 AGPC法は、solution D (タンパク変性剤と還元剤の混合液) でタンパクを変性させ(RNaseもここで失活する)、塩析し、析出してきたRNAをイソプロパノールで沈殿させるもので、現在最も汎用されている方法で、多くのキットも販売されている。ポイントは、1) 塩析を-20〜-30℃で行うこと(この温度では凍結しない。-80℃以下ではDNAまで析出してしまう)、2) RNA沈査は極少量なのでグリコーゲンや色素(NovagenのPellet Paintなど) で視覚化すること、3) DEPC処理滅菌超純水で溶解することである。その後の処置で、RNA溶液を70℃以上まで加熱する必要がある場合は、DEPC処理水(酸性) に溶解することは必須である(pH 7以上のRNA溶液を加熱すると、RNAのロスが大きい)。  AGPC法は、DNAが酸性条件下では、水層よりもフェノール層に移行しやすく、RNAが水層に残るという特性を利用している。しかし、多少のDNAの混入は避けられず、完全にDNAのコンタミを排除したい場合には、DNaseで処理をし、再度フェノール/クロロホルム処理とイソプロパノール沈殿を行ってDNaseを失活してRNAテンプレートとする必要がある。

3. RT反応とPCR

  1. RT反応
    1. 2.0 μl RNAテンプレートと 8.1 μl 超純水を95℃で1分間変性処理し、on ice で急冷する。
    2. RT反応液を以下の割合で用意する。BRL社や宝酒造の各種試薬を使用している。
      1. 10.1 μl  変性済みのRNAテンプレート
      2. 4 μl  5x RT バッファー
      3. 2 μl  0.1 M DTT
      4. 2 μl  10 mM dNTPs
      5. 0.4 μl  (100 pmoles)
      6. 0.5 μl [50U] RNase inhivitor
      7. 1.0 μl [200U] M-MLV Reverse transferase

        total 20 μl [ ] 内は最終濃度/量

    3. 37℃で1時間RT反応させる
    4. ゲル濾過などのマイクロスピンカラム(ファルマシア製など) により、プライマーを除去し、PCR用のcDNAテンプレートとする。
  2. PCR
    1. PCR反応液を以下の割合で用意する。
      1. 14.2 μl 超純水
      2. 2 μl 10x PCRバッファー
      3. 1.2 μl [1.5 mM] MgCl2 (25 mM)
      4. 1.6 μl [0.2 mM] dNTPs (2.5 mM)
      5. 0.2 μl [1 pmole] primer F (100 pmoles)
      6. 0.2 μl [1 pmole] primer R (100 pmoles)
      7. 0.5 μl template DNA
      8. 0.1 μl   DNAポリメラーゼ

        total 20 μl [ ] 内は最終濃度/量

    2. 混ぜる順序は、まず10xのPCRバッファーを超純水で希釈し、その後、安価な試薬から順に加えていく。途中で失敗に気付けば、なるべく金銭的ダメージ(多数のサンプルを扱っているときには、精神 的ダメージの方が大きい) の少ないようにという配慮から決めたものである。
    3. 温度設定プログラムは、図3のとおり。最初の denatureを95℃で5 min (Ex Taq)あるいは10min(AmpliTaq Gold) 行い、その後denature (95℃)・45 sec、annealing(55〜60℃)・75 sec、extension (72℃)・105 secを25〜30回繰り返す。サイクル後のextensionは 7 min とする。PCR終了後は、-20℃以下で凍結保存するまで、4℃で維持することが望ましい(室温に放置してもさほど問題にはならない)。20 baseのプライマーの場合、C%が50以上ならばアニール温度を60℃に、50未満であれば55℃にまず設定する。最良の条件はその後で、ゆっくり決定すればよい。
  3. アガロース電気泳動をかけてPCR産物を確認する。図4は、GC%が20〜40の20 baseプライマーを用いてPCRを行った結果を示している。1, 14レーンは、lファージDNAをHae・という制限酵素で切断したマーカーで、上から1,353, 1078, 872, 603 bpの各バンドが並び、その下に310, 281, 271, 234, 194, 118, 72 bp の断片が分離されずにまとまっている。アニールの温度が異なり、2〜5レーン は55℃、6〜9レーンは58℃、10〜13レーンは60℃ の条件で行っている。目的の産物は229と205 bp で、2, 3, 6, 7レーンでのみ認められ(矢頭)、アニール温度を60℃するとバンドが消失するのがわかる(10, 11レーン)。アニール温度を上げることによって、1,100 bp前後の非特異的なバンドが増加していることも見てとれる。この実験以降、これらプ ライマーを用いる場合には、55℃のアニール温度でPCRを行っている。ちなみに、図4は、ヒトのパラインフルエンザウイルス3型ウイルスの異なる2株(JS株とWash株)をPCR法を用いて鑑別する目的で開発したもので、1, 2, 5, 6, 9, 10レーンがJS株である。
  4. コントロール   PCRの結果、目的とする産物が得られたか否かを判断するために、当初は陰性と陽性のコントロールをおいておくべきである。実験材料すべてで  陰性あるいは陽性の結果が得られた場合に、酵素の失活やバッファー等のコンタミを疑わざるを得ないこともあるので、その際にこれらコントール が役にたつ。トラブルシューティング も参照 にしていただきたい。
    1. 陰性コントロール
      1. テンプレートを超純水に変更する(これが陽性にでたら、試薬のどれかがDNAでコンタミしている。重大問題!!)。
      2. RT-PCRでは、RT反応時にRT酵素抜きで行った産物をPCRのテンプレートする(ゲノムDNAのコ塔^ミがないことを確認できる)。
    2. 陽性コントロール
      1. 以前にPCRで増えたことの証明されているcDNAをテンプレートとする(これも増えなければ、酵素の失活、RNaseやDNase のコンタミ、あるいはDNA増幅装置の故障やプログラムミスを疑う)。
  5. トラブルシューティング
    1. バンドがまったくでない
      1. 酵素は失活していませんか?
      2. プライマーの設計は大丈夫ですか?
      3. DNA増幅装置の故障やプログラムミスは? 20 baseのプライマーの場合、GC%が50以下ならばアニール温度を60℃に、50未満では55℃に設定すれば、バンドがまったく得られないことはまずないので別の原因を考える必要がある。
    2. スメアがでる
      1. DNAポリメラーゼの量が多い → ピペッターの操作は大丈夫ですか?
      2. 最初の数サイクルの変性時間が短い
      3. 変性温度が低い → 96℃に上げる(それ以上は無意味)
      4. dNTPsが少ない → 50〜100 mM増やす
      5. extension時間が長い
      6. サイクル数が多い
      7. template DNA量が多い
    3. 非特異のバンドがでる
      1. プライマー濃度が高い
      2. プライマーのデザインが悪い → 場所を変えるか、もとのプライマーの3'側を伸ばした新しいプライマー(25〜30 base)を用意し、特異性を上げる
      3. DNAポリメラーゼの量が多い
      4. サイクル数が多い
      5. アニール温度が低い → 2〜3℃ずつ上げる
      6. 最初のアニールが特異的でない → 予めDNA増幅装置を95℃に加温しておき、これにかける直前まで、ミックスを氷温で維持するか(Ex Taq)、あるいはAmpliTaq Gold(PE) を用いる
      7. テンプレートDNA量が多い
      8. 変性温度が低い → 96℃に上げる(それ以上は無意味)
      9. Mg2+濃度が低い
      10. 原因がわからない → このPCR産物をテンプレートにして、内側のプライマーでnested PCRを行う
    4. ネガティブコントロールでも増える
      1. RNA抽出時にDNAがコンタミした → Rnase フリーのDNaseで処理してからRT反応を行う
      2. いずれかの過程でDNAがコンタミした → 状況が許せば、UV照射(15 min)や次亜塩素酸での酸化処理、オートクレーブ処理を行う。核酸の抽出からPCRまでの行程を、細菌や培養細胞を扱ったり、電気泳動するような場所から隔離されたスペースで行うことも重要である。

    《おわりに》 以上、基本的な事柄をのべてきました。製品名や会社名も具体的に入れてありますが、特別 "この製品でしかうまくいかない" というものではなく、また、リストに上らなくとも優れた製品が多数あろうかと思います。ほぼ偶然に、当施設で利用して、使えることを確認した製品にすぎないことを申し添えます。DNAやRNAは、基本的なことさえ知っていれば扱いの容易なものです。タンパク質のように、特別なコツが必要になるわけではなく、DNaseや RNaseのコンタミさえ避けられ、フェノール抽出とエタノール沈殿(エタチン)をクリアすれば、ちゃんと核酸を手に入れることができます。PCRについても再現性が高く、誰でも簡単に始めることができる一般的な手法となっています。" 核酸ま ではちょっと" と躊躇している御仁も、これを機会に、万障お繰り合わせの上、核酸ワールドにアシを踏み入れていただきたいと思います。

    《以下の本を参考にしました》

    1. PCR法最前線 蛋白質核酸酵素 (4月号増刊) 41(5) 1996 共立出版 (タイトルどおりの内容で、やや専門的)
    2. バイオ実験イラストレイテッド ・遺伝子解析の基礎 中山広樹、西方敬人 共著 秀潤社 (基本的な事柄がイラスト入りで詳しく書かれている。遺伝子を初めて扱う人にはもってこいです)
    3. バイオ実験イラストレイテッド ・本当にふえる PCR 中山広樹 著 秀潤社 (PCR初体験の人にはもってこい。今回、文章を書くにあたって、大いに参考にしました)
    4. ラボマニュアルPCR -研究と臨床診断への応用- 加藤郁之進 監訳 宝酒造 (内容的にはやや古い感があるが、種々のPCR法が具体的に書かれている良書)
    5. Short protocols in molecular biology 3 rd. ed. eds. F. M. Ausubel et al. Wiley & Sons (これから分子生物学に本格的に取り組もうとする人の座右の書)